Hráč se probouzí v zdánlivě opuštěné laboratoři a musí bez jakéhokoli vysvětlení, proč a kým byl do situace postaven, plnit nejrůznější fyzikální hádanky v mnoh
Hráč se probouzí v zdánlivě opuštěné laboratoři a musí bez jakéhokoli vysvětlení, proč a kým byl do situace postaven, plnit nejrůznější fyzikální hádanky v mnoha testovacích komorách. Cílem je otestovat nové zařízení Aperture Science Handheld Portal Device.
Příběh hry Portal je hráči odhalován prostřednictvím audiopřenisů a „hlášení“ od GLaDOS, a také pomocí vizuálních prvků v místnostech, na které hráč narazí v pozdějších úrovních. Podle knihy The Final Hours of Portal 2 je děj zasazen do „roku 2010“ – dvanáct let poté, co bylo výzkumné středisko Aperture Science opuštěno. Hra začíná v momentě, kdy se Chell probouzí ze stagnačního lůžka a slyší instrukce a varování ohledně nadcházejících testů od umělé inteligence známé jako GLaDOS. Chell postupně prochází jednotlivými komorami, které hráče seznamují s herními mechanikami. Hlášení GLaDOS slouží nejen jako instrukce pro Chell a navigace pro hráče, ale také dotvářejí atmosféru a polidšťují umělou inteligenci. Za dokončení všech testovacích komor je Chell přislíben dort. Chell prochází prázdným střediskem Enrichment Center a GLaDOS je jejím jediným komunikačním partnerem. Jak se hráč blíží ke konci, motivy a chování GLaDOS začínají být hrozivější. Ačkoli se snaží působit povzbudivě, její činy a promluvy naznačují neupřímnost a bezohledný nezájem o bezpečnost a blaho testovaných subjektů. Testovací komory jsou stále nebezpečnější; testy zahrnují ostrou palbu určenou pro vojenské androidy i místnosti zaplavené nebezpečnou kapalinou. V jedné z komor GLaDOS zdůrazňuje důležitost Weighted Companion Cube – bedny v úrovni pasu s růžovým srdcem na každé straně – pro dokončení testu. Vzápětí však GLaDOS prohlásí, že kostka musí být „eutanazována“ v nouzovém spalovači inteligence, aby Chell mohla pokračovat. Některé pozdější komory obsahují automatické střílny (turrety) s dětskými hlasy, které na Chell střílejí, aby s ní po svém zničení či vyřazení začaly soucítit. Poté, co Chell dokončí poslední testovací komoru, GLaDOS ji vmanévruje do spalovače ve snaze ji zabít. Chell však s pomocí portálové zbraně unikne a najde si cestu do servisních prostor Enrichment Centra. GLaDOS zpanikaří a tvrdí, že pokus o vraždu byl jen předstíranou součástí testování. Následně Chell vyzve, aby zaujala „polohu pro podrobení se doprovodu na oslavu“ v leže tváří k zemi, aby ji „asistent oslav“ mohl odvést za odměnou. Chell přesto pokračuje v útěku. V této části GLaDOS s Chell rozmlouvá a postupně vychází najevo, že umělá inteligence vyvraždila všechny ostatní v centru. Chell prochází údržbářskými šachtami a prázdnými kancelářemi za testovacími komorami, přičemž se občas řídí nápisy graffiti, které ukazují správný směr. Tyto zákulisní prostory, které jsou v extrémně zchátralém stavu, ostře kontrastují s nablýskanými testovacími komorami. Graffiti obsahují fráze jako „the cake is a lie“ (dort je lež) a parafráze básní Emily Dickinson, Henryho Wadswortha Longfellowa a Emily Brontë, které odkazují na smrt Companion Cube a oplakávají ji. GLaDOS se pokouší Chell odradit hrozbami fyzické újmy a zavádějícími tvrzeními, zatímco Chell proniká hlouběji do údržbářských prostor. Nakonec dorazí do obrovské haly, kde nad ní visí hardware GLaDOS. GLaDOS pokračuje ve vyhrožování, ale během výměny názorů z ní odpadne sféra, kterou Chell hodí do spalovače. GLaDOS odhalí, že Chell právě zničila procesor morálky neboli její svědomí – jedno z mnoha „jader osobnosti“ (personality cores), které zaměstnanci Aperture Science nainstalovali poté, co AI zaplavila centrum neurotoxinem. Po jeho odstranění získá GLaDOS k vypouštění plynu opět přístup. Začíná šestiminutové odpočítávání, během něhož Chell uvolňuje a spaluje další jádra osobnosti GLaDOS. Ta se ji snaží odradit verbálně pomocí posměšků a dětinských urážek, i fyzicky odpalováním raket. Jakmile Chell zničí poslední jádro, porucha rozmetá místnost a přenese vše na povrch. Chell poté leží před branami komplexu uprostřed trosek GLaDOS. Po oznámení Portal 2 byl závěr v pozdější aktualizaci rozšířen. V rámci této retroaktivní kontinuity je Chell z místa odtažena neviděnou entitou s robotickým hlasem, která jí děkuje za zaujetí „polohy pro podrobení se doprovodu na oslavu“. Závěrečná scéna po dlouhém průletu útrobami komplexu ukazuje dort Black Forest a Weighted Companion Cube obklopenou regály s desítkami zřejmě neaktivních jader osobnosti. Jádra se začnou rozsvěcovat, načež se snese robotické rameno, sfoukne svíčku na dortu a v místnosti nastane tma. Během závěrečných titulků GLaDOS přednese závěrečnou zprávu v podobě písně „Still Alive“. V ní prohlašuje experiment za obrovský úspěch a zároveň hráči naznačuje, že je stále naživu a že její „šťastné“ jádro nebylo vyřazeno.